实验中需要加多少抑制剂？ 

抑制剂的使用量受多种因素影响，包括抑制对象的可接触性，细胞通透性，孵育时间，细胞种类等等。我们建议通过检索文献确定使用抑制剂的起始浓度。如果有报道的Ki值或IC50值，可以采用其5-10倍的量开始尝试以达到抑制酶活性的最佳效果。如果抑制剂的Ki值或IC50值未知，则需要在更广泛的范围尝试抑制剂的使用浓度，并采用Michaelis-Menten动力学计算Ki值。采用高浓度抑制剂而没有抑制效果，甚至得到相反的结果等情况并不罕见。最好设立溶解抑制剂所采用的溶剂作为对照，以排除溶剂的非特异性影响。

 

EC50，ED50，Ki，IC50，Kd和pIC50各指什么？它们有什么区别？ 

药理和生化研究中，以下一些术语常常被用来描述药物或抑制剂的功效；有时如果研究者没有弄清原文献作者使用的术语的确切含义，在重复这些实验时会产生困扰。

EC50值：药物达到最大临床功效 (有时是抑制或刺激效果)50%时的浓度。这是一个药用术语。

ED50值：50%的个体表现特定药效时药物的有效剂量（而非浓度）。

IC50值:达到 50%抑制效果时抑制剂的浓度。

Ki值： 检测到 50%抑制效果时的抑制剂的浓度（采用Michaelis-Menten动力学计算而获得)。

Kd值：二个或更多生物分子组成的复合物分离成组分时的平衡常数 ；例如，抑制剂或底物从酶分离时的pIC50值。

pIC50值：IC 50值的10的负对数。

 

怎么确定做活体实验时需要注射多少抑制剂或者刺激物呢？ 

回答这个问题并不容易。需要通过一些经验性的预实验来获得试剂的优化剂量。首要考虑是这种试剂必须具备细胞穿透性。检索报道过的IC50值，ED50值或EC50值也非常必要。以下介绍一个抑制剂用量的常用估算方法：

以H-89（一种二氢氯化物）为例。这是一种细胞穿透性蛋白激酶A抑制剂，IC50值为48nM，分子量是519.3，240-480nM可以产生足够的蛋白激酶A的抑制效果。活体（in vivo）实验时我们还需要做一些估算。假定一只200g的大鼠含水量为70%，则抑制剂约在140ml中分布；这样240nM = 240nmoles/L=124.63μg/L。抑制剂溶于140ml，即124.63×0.140 = 17.45μg，所以这只200g的大鼠需要注射的剂量为17.45ug。同时，抑制剂在体内的实际分布与注射方式（静脉注射，肌肉注射还是腹腔注射？）药物利用率，半衰期，肝肾清除率，与蛋白的结合，组织特异性分布与富集等等紧密相关。特定组织或器官吸收抑制剂的量也往往比分离的细胞吸收量少。在整个活的动物体上的研究，常常要求抑制剂达到一定的目标浓度的负荷剂量，因此也需要通过持续给药以保持血液中相应的抑制剂浓度。同时，做这类实验必须总是特别小心，以免在动物上用药过量。

 

抑制剂的最适溶剂是什么？ 

一般来说，生物学实验中水常常是最佳溶剂。然而一些有机化合物难溶于水或遇水迅速降解，这时就要选用别的溶剂了。如果推荐用 DMSO作为溶剂，应该使用没有吸潮的新开封的DMSO，如果有潮气污染，很容易带来抑制剂降解或难溶的问题。

 

为什么不能直接用我的缓冲液对抑制剂DMSO母液做梯度稀释？ 

有时这并不会产生问题。但大多数情况下有机试剂直接加入水相介质时容易发生沉淀而析出。较好的做法是将抑制剂先以DMSO做梯度稀释，再将经过稀释的抑制剂加入缓冲液或细胞培养基。有些抑制剂甚至只有在其工作浓度下才能溶于水相。

 

哪种蛋白激酶抑制剂最适合我的实验？ 

如果磷酸化机制尚不明了，很多抑制剂，例如Staurosporine，可以先用来确定是否有蛋白激酶参与。紧接着，一个更特异的PKA抑制剂（例如H-89产品编号371963或8-Br-cAMP，Rpisomer产品编号116816）、PKC抑制剂（例如Bisindolylmaleimide产品编号203290)或PKG (例如KT5823产品编号420321或370654)来排除多种激酶参与反应的可能性。为了确切阐明调控机制，甚至需要选用同工酶特异性抑制剂，例如PKC就有不少这样的抑制剂可供选择。

 

怎么确定一个caspase抑制剂是可逆的还是不可逆的？ 

Caspase抑制剂的C端决定了其是可逆的或不可逆的。一般来说，有醛基（CHO）的caspase抑制剂是可逆的。CMK，FMK和FAOM等基团反应性更强，会与酶形成共价键，形成不可逆连联接。FMK较CMK反应略弱，因此被认为是酶抑制位点更特异的抑制剂。

 

某一特定caspase抑制剂的特异性由哪些因素决定？ 

多肽识别序列决定了 特定Caspase抑制剂的特异性。有时多肽的天冬氨酸残基经酯化以增加其细胞穿透性。VAD是通用的caspase抑制剂。早前VAD只是作为caspase-1 (ICE)的特异性抑制剂，现在发现它还能抑制caspase-3和caspase-4。在这个序列上再加一个酪氨酸残基（Y）形成YVAD，则是caspase-1的特异性抑制剂。DEVD序列识别caspase-3以及caspases-6，-7，-8和-10。

 

FMK型caspase抑制剂有什么优点？它们与CHO型的有什么不同？ 

FMK型caspase抑制剂会对酶的硫醇基团进行共价修饰，因此都是不可逆抑制剂。一般来说，在这种抑制剂的氨基末端都有一个苄氧羰基（Z）,生物素或乙酰基（Ac）。 这些基团都会增加抑制剂分子的疏水性，从而提高了其细胞穿透性。与带有生物素或Ac基团的抑制剂相比，带有Z基团的抑制剂的细胞穿透性更好。含生物素基团的抑制剂常常用于标识酶-抑制剂位点的检测。CHO型抑制剂的醛基可以与caspase酶的硫醇基间可逆形成一个加合物，因此这类抑制剂是可逆的。通常CHO型抑制剂是亲水的，因此细胞吸收较慢。可逆抑制剂的可逆情况与实际的pH值，金属离子浓度等条件有关。当醛基结合上天冬氨酸(D-CHO), 这个产物会以假酸醛形式动态平衡。这使得这类抑制剂有些许细胞穿透性。

 

选择蛋白酶抑制剂的原则是什么？ 

在处理细胞或组织时，要考虑到细胞会向培养基中分泌具有活性的蛋白酶，培养基本身也常常带有活性蛋白酶。因此，在样本制备的早期步骤中加入蛋白酶抑制剂是非常必要的。为了获得稳定的最佳效果，建议使用前新鲜配制抑制剂。长期存放在缓冲液中的抑制剂很可能失效，最好不要使用。不同的细胞或组织类型其含有的蛋白酶情况也有所不同。丝氨酸蛋白酶在各种细胞中广泛存在；细菌含有较多的丝氨酸蛋白酶和金属蛋白酶；动物组织抽提物富含丝氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶和金属蛋白酶，而植物抽提物含有更多的丝氨酸蛋白酶和半胱氨酸蛋白酶。此外，在制备IMAC（金属螯合亲和纯化，例如His·Tag纯化）材料时要避免使用EDTA。如果不太清楚样本中的蛋白酶种类，最好采用抑制剂混合物或者自行调配专用的抑制剂混合物。

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